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研究背景
子宫内膜蜕膜化是指子宫内膜基质细胞受到蜕膜化诱导因子的刺激,增生并分化形成的一种特殊组织,它对于妊娠的建立和维持具有至关重要作用。1908年Loeb首先通过机械刺激的方法使豚鼠子宫内膜产生蜕膜化变化。此后科学家们分别在大鼠、小鼠、兔和狗等动物体内成功进行了人工诱导蜕膜化实验,以上人工诱导蜕膜的模型主要是在妊娠的前提下进行。1929年Parkes首次在假孕雌性大鼠体内取得了人工诱导蜕膜化的实验。至1972年,人们发现除了机械刺激的方法可以实现人工诱导蜕膜化外,给予激素也可以达到同样的效果。1986年Wew—er等从妊娠第6—7天的小鼠子宫中分离的蜕膜细胞进行体外培养,也可形成类似蜕膜样结构。随着研究的进展,许多蜕膜化模型已建立,为生殖医学相关疾病的研究提供工具。
女性从青春期开始,随着卵巢功能的周期性变化,在卵巢分泌甾体激素的影响下,子宫内膜发生周期性剥落、出血、修复及增生,形成月经周期。非灵长类哺乳动物也有类似周期,但不表现为月经,而主要是某些行为的改变(如求偶行为),故称之为动情周期(estrous cycle)。在月经周期的分泌晚期,基质细胞增生分化形成前蜕膜细胞及蜕膜组织。受精卵着床于子宫内膜,前蜕膜细胞在妊娠黄体分泌的孕激素影响下,继续发育增大,成为蜕膜细胞及妊娠蜕膜。另外,在大鼠、小鼠啮齿类及兔、老虎哺乳类动物中,还可通过子宫内注射芝麻油、玻璃珠及子宫划伤等人工刺激方法实现子宫内膜蜕膜化。由此可知,子宫内膜蜕膜化的种类主要有2种,即妊娠蜕膜和人工蜕膜。

随着研究的深入,人们陆续发现很多分子参与蜕膜化过程,在子宫内膜蜕膜化及胚胎植入过程中起重要作用,如下图所示。蜕膜化标记分子因物种不同而有所差异。对于人而言,蜕膜化标记分子主要有C/EBPI3、Hoxa10、Foxol、Bmp2、Cx43、催乳素(PRL)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、ACP(酸性磷酸酶)、hsp27、MMP9和层粘连蛋白等;对于小鼠而言,蜕膜化的标记分子主要有Era、C/EBPI3、Hoxal0、Bmp2、Wnt4、Ihh、COUP—TFII(Nr2f2)、IL一11Ra、Cx43、FKBP52、dPRP、PR、Cyclin D3、PRL、IGFBP一1、ALP、MMP9等。其中PRL和IGFBP-l是人和动物中产生蜕膜化时最常见的2种标记分子。

子宫内膜的蜕膜化过程对于妊娠的建立和维持具有十分重要作用。蜕膜化异常将引起各种生殖疾病,如不孕不育、子宫内膜异位症和复发性流产等。子宫内膜异位症是一种很常见的生殖疾病,对于生育年龄段的妇女来说,子宫内膜异位会影响卵母细胞质量、卵泡发育、受精以及胚胎的着床,常导致不孕。Aghajanova等利用体外蜕膜模型研究发现,孕酮调节紊乱,常导致子宫内膜异位症、子宫内膜的病理性生长。另外,体内研究发现,子宫内膜蜕膜化受损是内膜异位症患者不孕的病理性基础。最近,研究者通过蜕膜化模型发现,子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病,在子宫内膜异位症患者中,芳香化酶的表达量明显增加,催化睾酮转化为雌激素。另外,研究发现SF一1、孤儿核受体以及基质细胞的DNA去甲基化,均会增加芳香化酶的表达。 复发性流产是产科常见病之一,其发病原因目前仍不完全清楚。子宫内膜蜕膜化和蜕膜的正常发育是妊娠继续的先决条件,其异常常导致流产的发生。近年来利用蜕膜模型发现内膜局部的一些细胞因子、酶类、功能蛋白等形成复杂的网络,参与了子宫内膜功能的调节,如HOXA10。HOXA10是同源框基因家族中Ardb亚家族成员之一,参与子宫形态发生和发育的调控。研究发现,HOXA10基因在小鼠妊娠蜕膜组织中持续高表达。Bagot等利用基因转染技术将HOXA10基因表达的质粒转染到怀孕第2天的小鼠子宫,研究发现小鼠活产率显著高于对照组。Rahman等发现HOXA10基因缺乏小鼠子宫蜕膜组织中,自然杀伤(NK)细胞分化异常,而NK细胞的分化异常将导致母胎免疫耐受缺陷而致胚胎流产。表明HOXA10基因对胚胎着床和妊娠均具有重要作用,H0XA10的异常可能会导致复发性流产发生。
研究模型
我们已经掌握了子宫内膜基质细胞的原代分离培养:采用机械方法去除腔上皮细胞。首先将子宫组织纵向剪开,有利于胰酶消化腔上皮细胞;消化后用镊子将组织块从培养皿中拣出,利于去除腔上皮细胞;然后通过胶原酶Ⅱ消化及差时贴壁等方法,分离和纯化子宫内膜基质细胞。接种后的基质细胞0.5 h开始贴壁,培养24 h后,细胞成纤维样生长,呈现两种形态:梭形和多角形(主要为三角形或星形),排列成放射状,并不紧靠连成片;细胞免疫化学方法染色显示,分离纯化的子宫基质细胞Vimentin染色呈阳性,而Cytokeratin 染色呈阴性,如下图所示。

我们建立了子宫内膜基质细胞蜕膜化的模型:在雌、孕激素处理的基础上再加入cAMP三者联合诱导产生蜕膜化。采用三者联合诱导的原因是雌激素可使子宫内膜增生,cAMP可通过调节转录因子的活性来增加子宫内膜基质细胞对孕酮的敏感性;同时通过检测蜕膜化的标志分子如PRL、IGFBP-1、ACP(酸性磷酸酶)、hsp27和层粘连蛋白等来判断诱导蜕膜是否成功。子宫内膜基质细胞产生蜕膜化后,经HE染色显示,细胞核呈现多核化,胞体大而圆,为蜕膜化成功一个标志,如下图所示。

研究案例
目的:研究硫化氢对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响
结论:硫化氢可以对子宫内膜基质细胞蜕膜化起到促进作用,其中H2S合成酶起到了主要作用
路线:
  • 临床收集人子宫内膜组织标本,IHC检测表明在子宫内膜组织的基质细胞和上皮细胞中均可表达H2S合成酶CBS和CSE
  • 对人子宫内膜基质细胞进行原代分离、培养,构建体外蜕膜化模型。用WB检测,发现CBS和CSE在蜕膜化过程中表达增加,CBS的增加更为明显,提示H2S参与了蜕膜化过程。
  • 在蜕膜化过程中分别加入了CBS的抑制剂AOAA、CSE的抑制剂PAG,抑制H2S合成;结果提示,CBS的合成收到抑制后,蜕膜化程度降低。CSE的合成收到抑制后,蜕膜化程度无明显改变。
核心文献
  • Derivation of human decidua-like cells from amnion and menstrual blood. Sci Rep. 2014 Apr 8;4:4599. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/24710473/
  • Uterine selection of human embryos at implantation. Sci Rep. 2014 Feb 6;4:3894. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/24503642/
  • Elevated periimplantation uterine natural killer cell density in human endometrium is associated with impaired corticosteroid signaling in decidualizing stromal cells. J Clin Endocrinol Metab. 2013 Nov;98(11):4429-37. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/24025400/
  • Endometrial Intracrinology--generation of an estrogen-dominated microenvironment in the secretory phase of women. J Clin Endocrinol Metab. 2013 Nov;98(11):E1802-6. http://press.endocrine.org/doi/10.1210/jc.2013-2140?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed
  • Endometrial inhibin/activin beta-B subunit expression is related to decidualization and is reduced in tubal ectopic pregnancy. J Clin Endocrinol Metab. 2008 Jun;93(6):2375-82. http://press.endocrine.org/doi/10.1210/jc.2008-0136?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed

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