研究背景 支气管哮喘（简称：哮喘）是一种常见病、多发病。目前，全球哮喘患者约3亿人，中国哮喘患者约3000万。哮喘是影响人们身心健康的重要疾病。治疗不及时、不规范，哮喘可能致命。控制不佳的哮喘患者对日常工作及日常生活都会发生影响，可导致误工、误学，导致活动、运动受限，使生命质量下降，并带来经济上的负担及对家人的生活发生负面影响。哮喘反复发作可导致慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、肺心病、心功能衰竭、呼吸衰竭等并发症。 哮喘发病的危险因素包括宿主因素（遗传因素）和环境因素两个方面。遗传因素在很多患者身上都可以体现出来，比如绝大多数患者的亲人（有血缘关系、近三代人）当中，都可以追溯到有哮喘（反复咳嗽、喘息）或其他过敏性疾病（过敏性鼻炎、特应性皮炎）病史。大多数哮喘患者属于过敏体质，本身可能伴有过敏性鼻炎和/特应性皮炎，或者对常见的经空气传播的变应原（螨虫、花粉、宠物、霉菌等）、某些食物（坚果、牛奶、花生、海鲜类等）、药物过敏等。哮喘的炎症是多种细胞及其释放的物质参与的慢性过程，与气道高反应性有关，但是炎症的剧烈程度与病情的关系尚不明确。炎症遍布于整个气管树，在软骨支气管尤其明显。很多细胞参与炎症的过程，但并不存在占主导地位的细胞，细胞间的相互作用也不甚清楚。与炎症有关的炎症介质可能超过100种，每一种炎症介质都可能有多重效应，因此，要搞清楚单个炎症介质在哮喘中所起的作用并不容易。 现在认为哮喘的反复发作是由于T淋巴细胞及某些结构细胞（如上皮细胞）释放细胞因子的网络调控异常导致炎症-上皮损伤-气道重塑的恶性循环过程（如下图所示）；上皮细胞脱落-重建过程能导致气道上皮下间质结构的改变,上皮细胞产生的Fn是纤维细和上皮细胞本身的趋化因子；上皮细胞分泌的有丝分裂原也能刺激纤维细胞的增殖，纤维细胞的聚集过程与皮肤疤痕形式相似；此外上皮来源的TGF-β还能上调上皮下的纤维细胞产生基质分子，包括I型胶原纤维和Fn，故脱落-重建过程反复发生可导致网状基底膜增厚。 已发现，支气管上皮不仅仅是保护组织免受外界侵害的生理屏障，在炎症反应中也起重要作用。上皮细胞受刺激后或自发地合成及分泌许多介质，它们能促进粘液分泌、增加血管渗出，使平滑肌收缩、引起对吸入变应原的速发及迟发性反应，是哮喘发病的重要介质。另外，支气管上皮细胞是复杂的细胞因子及趋化因子的重要来源。其合成及分泌的细胞因子及趋化因子有白介素-8、-6，粒细胞巨噬细胞集落刺刺激因子（GM-CSF），肿瘤坏死因子（TNF-α）、巨噬细胞炎性蛋白，单核细胞趋化肽，调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子。IL-8是重要的中性粒细胞趋化因子，与重症哮或哮喘加重有关；IL-6的作用不甚清楚，它似乎参与T细胞的活化，诱导B细胞的终未分化及免疫球蛋白的产生；GM-CSF、RANTES是嗜酸粒细胞趋化因子，后者还促使记忆T细胞向气道迁移，也选择性的吸引CD4+细胞，并且也是成熟T细胞的趋化因子。MIP、MCP除能趋化单核细胞、嗜酸粒细胞及嗜碱细胞外，还可使CT细胞、B细胞增殖。上皮细胞也能表达细胞间粘附分子ICAM-1，它在中性粒细胞、嗜酸粒细胞跨越血管内皮细胞向气道迁移的过程起重要作用。许多研究提示哮喘患者上皮细胞中ICAM-1的表达上调。通过上述细胞因子、趋化因子及粘附分子，上皮细胞可将嗜酸粒细胞、中性粒细胞等炎性细胞征募到气道局部，炎性细胞进一步分泌炎性介质引起气道的炎症反应。所以上皮细胞具有启动哮喘气道炎反应并使之持久化的作用。

研究模型

我们已经掌握了原代支气管上皮细胞的分离培养：切除新鲜肺组织，去除支气管外的其他组织，保留主支气管和小的支气管，使用PBS充分冲洗后，剪成碎片，加入含蛋白酶XIV的消化液中，4度过夜消化，收集细胞悬液，接种在包被胶原的培养瓶中，无血清培养基进行原代培养。1天后细胞逐渐贴壁；3-4天后细胞开始逐渐变大，呈多边形（如下图所示）。

我们建立了冷刺激支气管上皮细胞的模型（冷空气刺激是慢性气道炎症性疾病的一个重要急性加重因素）：在冷刺激之下，支气管上皮细胞被激活从而诱导钙离子内流并进一步导致多种细胞因子及趋化因子的产生，如下图所示。

研究案例 目的：研究氧化应激对支气管上皮细胞CFTR门控功能的影响 结论：臭氧应激抑制了支气管上皮细胞上CFTR的表达及功能；臭氧应激后，NO、ROS产生增多，参与并激活了STAT1的磷酸化，抑制了CFTR的表达。 路线： 1.用臭氧连续应激大鼠3天（每天1小时），建立气道高反应动物模型。免疫荧光结果显示，臭氧应激的大鼠支气管上皮顶膜及胞浆中CFTR明显减少。

2.应用臭氧攻击支气管上皮细胞30分钟，建立氧化应激模型。qPCR显示，臭氧应激4h后，CFTR表达明显下降。

3.为研究氧化应激抑制CFTR表达的信号机制，在臭氧应激前，支气管上皮细胞被JAK2激酶抑制剂AG490预处理4h，qPCR发现臭氧刺激后，AG490能增加CFTR的表达，AG490单独处理对CFTR表达没有影响

4.臭氧处理后，STAT1的磷酸化水平随时间依赖性增加。通过应用小分子抑制剂预处理细胞，显示AG、ZnPP-9、NAC均降低了臭氧诱导的STAT1磷酸化

5.对臭氧应激条件下CFTR的转录因子调节谱进行了研究：用EMSA观察到ERa与Sp1的结合活性；臭氧应激4h后，Sp1/ERa与CFTR的启动子区的结合活性及核转位降低，抑制CFTR转录。

核心文献

The airway epithelium in asthma. Nature Medicine 18, 684–692 (2012). http://www.nature.com/nm/journal/v18/n5/full/nm.2737.html Endotyping asthma: new insights into key pathogenic mechanisms in a complex, heterogeneous disease. Lancet 372, 1107–1119 (2008). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18805339 Divergent functions for airway epithelial matrix metalloproteinase 7 and retinoic acid in experimental asthma. Nat. Immunol. 10, 496–503 (2009). http://www.nature.com/doifinder/10.1038/ni.1719 Defective epithelial barrier function in asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 128, 549–556.e1–12 (2011). http://dx.doi.org/10.1016/j.jaci.2011.05.038 Increased IL-33 expression by epithelial cells in bronchial asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 125, 752–754 (2010). http://dx.doi.org/10.1016/j.jaci.2009.12.935